G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳黴素

G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳(chuan) 黴素

基本信息CAS號  108321-42-2

分子式  C20H40N4O10·2 H2SO4

分子量  692.7 g/mol

外觀  白色粉末

純度  ~98%

活力溶解性  >700 μg/mg 溶於(yu) 水

產(chan) 品簡介

       G418 Sulfate（G418硫酸鹽），也稱作Geneticin（遺傳(chuan) 黴素），是一種結構類似於(yu) 慶大mei素B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳(chuan) 黴素通過影響80S核糖體(ti) 功能和阻斷延伸步驟來幹擾蛋白合成，對原核和真核等細胞都有毒性，包括細菌、酵母、高等植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。其抗性基因（主要為(wei) neo基因）位於(yu) 轉座子Tn601（903）或Tn5（來源於(yu) 細菌），但是可以在真核細胞中表達。通過基因重組技術將這些抗性基因導入細胞，使其獲得對G418的耐藥性，從(cong) 而用來篩選和維持培養(yang) 攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。 哺乳動物細胞中，當抗性基因neo被整合進真核細胞基因組後，使其編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase，APH(3')II）。此酶通過共價(jia) 修飾G418的氨基或羥基功能，抑製抗生素-核糖體(ti) 間的相互作用，從(cong) 而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chan) 生抗性。穩轉細胞株篩選實驗，需要建立殺滅曲線（劑量反應曲線）確定殺死無抗性細胞的zui低有效濃度。 植物細胞中，通過轉染攜帶nptII基因的抗性質粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶，這個(ge) 酶使得多種抗生素喪(sang) 失活性，包括G418，卡那mei素和巴龍mei素。

使用說明

1. G418儲(chu) 存液的配製（50 mg/mL，活性濃度）

   （1）活力單位的換算

根據此公式進行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而異。可見批次對應的質檢報告，或者瓶子上的標簽。A₁是想配製的活性G418濃度。A₂是實際稱重的粉末與(yu) 體(ti) 積比濃度。

比如若所用批次的G418 活力值為(wei) ：750 µg/mg，要配製50 mg/mL的G418活性濃度，則實際要配製的粉末濃度為(wei) 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

如果配製10 mL的G418儲(chu) 存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取663.3 mg粉末。

（2）除菌和保存

根據上述換算得到的實際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nei) 使其wan全溶解。

先用5 mL無菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過濾器，除盡水。之後使用此濾器過濾，除菌後分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存，1年穩定。

【注】

     ①不要對混濁的溶液進行過濾，因為(wei) 混濁的溶液意味著未wan全溶解，過濾過程中會(hui) 造成藥物損失，降低終液的活性。

     ②不建議使用液體(ti) 培養(yang) 基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來製備儲(chu) 存液。

2. 常用篩選濃度

一般來說，剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418，並用一個(ge) 較低濃度的G418用於(yu) 維持培養(yang) 。生長條件，細胞類型和其他的環境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實驗體(ti) 係建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定最佳篩選濃度。

通常情況，哺乳動物細胞篩選範圍200-2000 μg/mL；植物細胞：10-100 μg/mL；酵母細胞：500-1000 μg/mL。

以下是一些細胞類型使用G418篩選使用的濃度，可做參考。

3. 殺滅曲線的建立

 【注意事項】為(wei) 了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素zui低濃度，可通過建立殺滅曲線來實現，至少選擇6個(ge) 濃度。處理分裂期的細胞時G418的活性zui強，因此在添加G418之前需要讓細胞培養(yang) 一段時間。

（1）第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yang) 板上，37℃，CO₂培養(yang) 過夜。

     【注】對於(yu) 需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

（2）根據細胞類型，設定合適範圍內(nei) 的濃度梯度。以哺乳動物細胞為(wei) 例，可設定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

（3）第二天：去除舊的培養(yang) 基，換用新鮮配製的含有相應濃度藥物的培養(yang) 基。每個(ge) 濃度做三個(ge) 平行孔。

（4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yang) 基。

（5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內(nei) 能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為(wei) 穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

4. 穩定轉染細胞的篩選

      （1）轉染48 h後，用含有適當濃度的G418篩選培養(yang) 基來傳(chuan) 代細胞（直接傳(chuan) 代或者稀釋後傳(chuan) 代）。

    【注】細胞處於(yu) 活躍分裂狀態時抗生素的殺傷(shang) 效果好。當細胞過於(yu) 稠密，其效率會(hui) 降低。為(wei) 了得到較好的篩選效果，請最好將細胞稀釋至豐(feng) 度不超過25%。

（2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yang) 液。

（3）篩選7天後觀察並評估細胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決(jue) 於(yu) 宿主細胞類型，轉染以及篩選效果。

（4）挑取並轉移5-10個(ge) 抗性克隆於(yu) 35 mm細胞培養(yang) 板，繼續用含藥物的篩選培養(yang) 液維持培養(yang) 7天。

（5）之後更換正常培養(yang) 基培養(yang) 即可。

運輸與(yu) 保存方法

常溫運輸。-20℃避光保存，有效期3年。避免受潮，否則會(hui) 降低抗生素活力。

注意事項

（1）本品不可高壓滅菌；

（2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青mei素/鏈mei素）共同使用，因為(wei) 它們(men) 是G418的競爭(zheng) 性抑製劑。其他的抗生素也會(hui) 產(chan) 生交叉活性。

（3）配製G418溶液時，一定要根據G418批次不同的活力值（potency）來進行換算，從(cong) 而得到需要活性濃度的儲(chu) 存液及工作液。

（4）G418加入培養(yang) 體(ti) 係中未轉染的細胞有可能不會(hui) 被殺死，原因在於(yu) 藥物濃度過低，或者細胞密度過高。另外，快速分裂的細胞相對於(yu) 緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞（未轉染）可能抗生素添加5-7天後才能殺死，轉染細胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

（5）即使加入殺死劑量的G418，細胞可能會(hui) 繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2天後才變得明顯。

（6）為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。