熱不穩定性耐高鹽核酸酶

無論是實驗室規模樣品製備、還是生產(chan) 規模工藝過程，去除核酸都可以改善工藝流程，如蛋白純化、病毒載體(ti) 製備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN) 是一種非特異性內(nei) 切酶，在高鹽濃度下具有最佳活性；且該酶在多種緩衝(chong) 液中都有活性，很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應用中，更為(wei) 適合。

核酸汙染，特別是宿主基因組DNA汙染，在幾乎所有工藝流程及生物製品的生產(chan) 中，都是需要重點解決(jue) 的問題。一方麵，宿主DNA的存在，影響目標產(chan) 物的純化及下遊質量分析等。另一方麵，宿主DNA殘留能引起機體(ti) 嚴(yan) 重的免疫反應，是生物製品的關(guan) 鍵質量參數之一，FDA及NMPA等對Host Cell DNA (HCD)有嚴(yan) 格的質控要求。宿主基因組DNA中，組蛋白與(yu) DNA形成核小體(ti) ，核小體(ti) 緊密折疊形成結構複雜的染色質。組蛋白與(yu) DNA間存在強烈的離子作用及疏水作用，再加上特殊的結構，導致宿主DNA很難被準確檢測並清除。已有文獻表明，高鹽濃度下組蛋白與(yu) DNA解離相對徹di，這有利於(yu) 宿主DNA的檢測及去除。但市售的絕大多數核酸酶在高鹽濃度下活性很弱，甚至wan全失活。而熱不穩定性耐高鹽核酸酶，HL-SAN成了這類應用的理想選擇。

高鹽條件下，DNA清除效率更高，宿主DNA殘留更少；

pI為(wei) 9.6，容易跟絕大多數蛋白分離；

還原劑存在時，酶易失活，減少對後續流程的影響。

圖 1：高鹽度溶液中的最佳活性。HL-SAN 在約 0.5 M NaCl 下具有最佳活性，但在 [NaCl] 和 [KCl] 的廣泛範圍內(nei) 運行。HL-SAN 的活性在 25 mM Tris-HCl 緩衝(chong) 液、pH 8.5、5 mM MgCl 2 和不同的 [NaCl] 或 [KCl] 中測試。最大活性設置為(wei) 100%。

圖 2：溫度和活動。HL-SAN 在 ~35°C 時具有最佳活性，但在很寬的溫度範圍內(nei) 起作用（10°C 和 50°C 下的活性為(wei) 20%）。在含有 5 mM MgCl 2 和 0.5 M NaCl 的pH 8.5 的 25 mM Tris-HCl 緩衝(chong) 液中測試 HL-SAN 的活性。

圖 3： MgCl 2 和 MnCl 2 濃度對 HL-SAN 活性的影響。

在 25 mM Tris-HCl 緩衝(chong) 液、pH 8.5、0.5 M NaCl 和不同濃度的 MgCl 2 或 MnCl 2 中測試 HL-SAN 的活性。將含有 5 mM MgCl 2的樣品的活性 設為(wei) 100%。

圖 4： HL-SAN 將 ssDNA 消化為(wei) ~5-13 nt，將 dsDNA 消化為(wei) ~5-7 nt。ssDNA 最終產(chan) 物的大小從(cong) ~5-13 nt 不等，而 dsDNA 被消化到大約 ~5-7 nt。最終產(chan) 物的大小似乎取決(jue) 於(yu) DNA 序列。底物 1 和 2 是具有不同序列的 ssDNA，底物 3 和 4 是具有相似序列但在不同末端具有 FAM 標記的 dsDNA。底物 5 是 dsDNA，其序列與(yu) 底物 3 和 4 相同，但兩(liang) 端帶有 FAM 標記。

病原微生物檢測應用，如宏基因組測序（mNGS）樣品去除宿主DNA；

蛋白純化，特別是DNA結合蛋白；

病毒載體(ti) 製備，如腺相關(guan) 病毒（AAV）、腺病毒（AdV）等；

其他需要去除宿主DNA的應用等。

1、Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection.

Charalampous T, Kay GL, Richardson H, Aydin A, Baldan R., Jeanes C, Rae D, Grundy S, Turner DJ, Wain J, Leggett RM, Livermore DM, O’Grady J.

Nature Biotechnology. 2019; 37: 783–792.

2、A Structured Workflow for Mapping Human Sin3 Histone Deacetylase Complex Interactions Using Halo-MudPIT Affinity-Purification Mass Spectrometry.

Banks CAS, Thornton JL, Eubanks CG, Adams MK, Miah S, Boanca G, Liu X, Katt M, Parmely T, Florens LA, Washburn MP.

Molecular & Cellular Proteomics. 2018; 17 (7): 1432-1447.

3、Biochemical characterization of ParI, an orphan C5-DNA methyltransferase from Psychrobacter arcticus 273-4.

Grgic M, Williamson A, Kjaereng Bjerga GE, Altermark B, Leiros I.

Protein Expr Purif. 2018; 150: 100-108.

4、Biochemical Characterization of a Family 15 Carbohydrate Esterase from a Bacterial Marine Arctic Metagenome.

De Santi C, Willassen NP, Williamson A.

PLoS ONE. 2016; 11(7): e0159345.

5、Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida.

Williamson A, Pedersen H.

Protein Expr Purif. 2014; 97: 29-36.

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本產(chan) 品主要用於(yu) 科研領域，不宜用於(yu) 臨(lin) 床診斷或其他用途。

來源：在畢赤酵母中重組生產(chan) 。

活性：HL-SAN在10-50°C的溫度範圍內(nei) 具有高活性。 活動的最佳 NaCl 濃度為(wei) 0.5 M，工作範圍為(wei) 0.25–1 M。活動需要 Mg2+ (>1 mM)。 工作 pH 範圍為(wei) 7.5-9.5，最佳 pH 值為(wei) 9.0。

比活度：≥ 175 000 Units/mg。

單位定義(yi) ：一個(ge) 單位定義(yi) 為(wei) 在 37°C 下 30 分鍾內(nei) 1 A 在 260 nm 處的吸光度增加，使用 50 μg/ml 小牛胸腺 DNA（D-1501，Sigma）在由 25 mM Tris-組成的緩衝(chong) 液中 HCl，pH 8.5 (25°C)，5 mM MgCl2，500 mM NaCl。