聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)

• GMP級別定製監管，支持並滿足合規要求。

• 不含動物源性成分。

• 嚴(yan) 格遵循以下規範生產(chan) 1. ISO 9001:2015, certified facility。

• 嚴(yan) 格按照《GMP 附錄-細胞治療產(chan) 品》國家藥品監督管理局。

• 從(cong) 工藝開發到臨(lin) 床試驗和商業(ye) 化的無縫過渡生產(chan) 細胞係（HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chan) 量。

操作方法參考

 一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為(wei) 例：（一）轉染前準備1) 轉染前一天：用膠原酶 I型（78CL10002)消化細胞並計數（不建議用yi酶）。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5�S wan全培養(yang) 基和 1ml 的細胞懸液)置於(yu) 37°C,5%CO2培養(yang) 箱培養(yang) 24h。2) 24h 後,移除之前培養(yang) 基，每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5�S。注意：確保 293T 細胞生長狀態良好傳(chuan) 代 不超過 15 代。（二）轉染過程3) 第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度， 當細胞達到 70%到 80%的匯合度時，開始準備轉染。4) 對於(yu) 每孔細胞，用 100µl 無血清培養(yang) 基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yang) 基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為(wei) 1ug/ml（DNA/總培養(yang) 體(ti) 積）。5) 對於(yu) 每孔細胞，用 100μL 無血清培養(yang) 基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yang) 基）稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依據自己實驗摸索最適比例。6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中（總體(ti) 積 200µL）輕輕混勻， 室溫孵育 30 分鍾。7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP複合物滴加到細胞培養(yang) 板每個(ge) 孔中，輕輕搖動培養(yang) 板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。8) 將培養(yang) 板放入 37°C，5%CO2培養(yang) 箱培養(yang) 中培養(yang) 24h。（三）觀察轉染結果 9) 第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過 80%的 293T 細胞在轉染後的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優(you) 化，以達到最適比例， 通常篩選範圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI，用BIOHUB-PRO  GMP時應適當 降低使用濃度。      通常情況下，分別準備BIOHUB-PRO GMP  GMP和 DNA 轉染溶液時其體(ti) 積一般是轉染前每孔細胞培 養(yang) 液體(ti) 積總量的 1/10-1/20，如細胞培養(yang) 液體(ti) 積為(wei) 3ml，則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體(ti) 積為(wei) 150ul。質粒 DNA 的濃度通常為(wei) 1ug/ml（DNA 質量/細胞培養(yang) 總體(ti) 積）[1][4]。 不同質粒種類以及大小會(hui) 影響轉染效率，如較大片段插入質粒可能轉染效率低，可根據 實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。 HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反複吹打，但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞，如果表達的是膜蛋白，yi酶消化細胞可能會(hui) 降低蛋白表達， 建議用膠原酶消化細胞，我們(men) 推薦用(78CL10002)的膠原酶。 對於(yu) 貼壁性低的細胞係，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與(yu) 培養(yang) 皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養(yang) 基和78BioPEI GMP與(yu) DNA 的最佳比例，就可以在轉染後 24 至 96 小時內(nei) 多次觀察轉染效率，以優(you) 化最大表達量時間點。二、懸浮細胞轉染 離心對數期生長的細胞用新鮮的培養(yang) 基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規模轉 染時，如需大規模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 細胞 於(yu) 100mL 培養(yang) 瓶（溶液體(ti) 積占瓶體(ti) 積的 1/5）操作體(ti) 係舉(ju) 例如下：（一）轉染前準備 1) HEK293F 細胞傳(chuan) 代接種於(yu) 20mL 懸浮細胞生長培養(yang) 基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的條 件下培養(yang) 。當細胞密度到 1X10 6cells/mL，然後旋緊瓶口放入搖床繼續培養(yang) ，2~4 小時 後可以進行轉染。（二）轉染過程 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yang) 基)稀釋適量的 DNA，使 DNA 終濃度為(wei) 1ug/ml（DNA/總 培養(yang) 體(ti) 積）。混勻並靜置 5min。 3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養(yang) 基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO  GMP，混勻並靜置 10min。（78BioPEI：DNA 參考比例範圍，可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO  GMP和 DNA 優(you) 化方案優(you) 化）。 4) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中輕輕混勻，室溫孵育 30 分鍾。 5) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染複合物逐滴加入到細胞培養(yang) 液中，搖勻後旋緊瓶口放回搖床 （36.5℃，5%CO2，120rpm）。 6) 基因表達可在 24-72 小時後檢測，具體(ti) 時間取決(jue) 於(yu) 細胞係和轉基因. 小貼士:在懸浮培養(yang) 中，單個(ge) 細胞的轉染效率要高於(yu) 聚集在一起的細胞，需要優(you) 化適合單細胞的 生長條件。方形瓶應經過兩(liang) 個(ge) 連續的幹燥循環高壓滅菌（每個(ge) 45 分鍾，幹燥 15 分鍾） 蓋子應盡可能鬆，不得脫落。應該讓它們(men) 冷卻擰緊蓋子前，將其wan全放入層流罩中。如果瓶子向內(nei) 塌陷，細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產(chan) 量，有參考文獻表明轉染後 24 小時，可以適當稀釋細胞，稀 釋比例參考範圍（1:2—1:5）之間，可以增加蛋白產(chan) 量，稀釋效應與(yu) 最佳稀釋比率應根 據經驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉染，但必須經過上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優(you) 化。

注意事項

1. 不同質粒種類以及大小會(hui) 影響轉染效率，可如較大片段插入質粒可能轉染效率低，可根據實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。

2. 細胞狀態及代數會(hui) 較大程度影響轉染。剛複蘇細胞需傳(chuan) 代2-3次以上，待細胞生長穩定後做轉染實驗。為(wei) 保證實驗穩定性，轉染細胞盡量選擇20代以內(nei) 進行實驗。

3. 對於(yu) 貼壁性低的細胞係，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與(yu) 培養(yang) 皿之間的粘附性。

4. 初次使用應優(you) 化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉染效率。 DNA 和轉染試劑的比例， 通常推薦是1:2-1:3，通過調整DNA/BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑比例優(you) 化轉染效率，調整範圍DNA（μg）:BIOHUB-PRO  GMP（μL） 比值在1：0.5-1：5。

5.  為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。