mRNA疫苗相關產品-起發生物

mRNA疫苗相關(guan) 產(chan) 品-起發生物

一、mRNA疫苗生產(chan) 可分為(wei) 兩(liang) 大塊：mRNA製備和脂質微粒進行包封

mRNA疫苗生產(chan) 可分為(wei) 兩(liang) 大塊，可以類比為(wei) “原料藥"（mRNA）的生產(chan) 和純化，以及“製劑"（利用脂質微粒進行包封）階段。原料藥（mRNA）生產(chan) 涉及DNA原液製備和mRNA原液的製備，mRNA原液的製備（體(ti) 外轉錄），是整個(ge) mRNA工藝流程中核心的步驟，而原料主要是酶。

(一)mRNA疫苗的生產(chan)

mRNA疫苗生產(chan) 可分為(wei) 兩(liang) 大塊，原料藥（mRNA）的生產(chan) 以及製劑（利用脂質微粒進行包封）階段。mRNA生產(chan) 涉及DNA原液製備和mRNA原液的製備。所以mRNA疫苗的生產(chan) 可分為(wei) 三大階段，第一步DNA原液製備，第二步mRNA原液的製備，第三步是利用脂質微粒進行包封。

第一步：DNA模板生產(chan) ，主要是質粒生產(chan) 。編碼抗原的DNA模板生產(chan) ，常用大腸杆菌大規模體(ti) 內(nei) 表達，最後提取和純化攜帶目的序列的質粒；

第二步：mRNA原液的製備轉錄，由DNA到mRNA。在無細胞的反應器內(nei) 進行轉錄，通過T7、SP6或T3等RNA多聚酶作用，通過一步或者兩(liang) 步法轉錄成為(wei) mRNA，同時加上5’的Cap及3’的PolyA尾巴，在進一步使用DNA酶將殘留的DNA模板進行消除；純化，使用離子交換等層析步驟進一步將轉錄形成的mRNA進行純化，進行超濾濃縮形成原液；

第三步：製劑階段，利用脂質微粒進行包封。通過微流體(ti) 泵精確地控製著mRNA原液和脂質流速，將他們(men) 混合成脂質納米粒LNP。最後則是成品的灌裝及質量控製，貼簽形成終產(chan) 品。

 二、mRNA合成過程所需原料

（一）國內(nei) 外mRNAxin冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下：

1）BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通過T7RNA聚合酶對DNA進行純化和體(ti) 外轉錄。

總結：轉錄采用一步法，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。

2）mRNA-1273–Moderna

利用優(you) 化的T7RNA聚合酶介導的轉錄反應在體(ti) 外合成了編碼序列優(you) 化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷wan全取代。轉錄後，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭(lan) 生物實驗室）和痘苗2′O-甲基轉移酶（新英格蘭(lan) 生物實驗室）將Cap1結構添加到5’端。通過oligodT親(qin) 和純化純化mRNA，通過切向流過濾將緩衝(chong) 液交換到pH為(wei) 5.0的醋酸鈉中，無菌過濾，並在-20°C下冷凍，直到進一步使用。

總結：轉錄采用兩(liang) 步法，需要加帽酶的參與(yu) ，甲基假尿苷取代尿苷。

3）ARCoV-艾博生物

該mRNA在體(ti) 外使用T7RNA聚合酶介導的轉錄從(cong) 質粒ABOP-028（GENEWIZ）的線性化DNA模板中產(chan) 生，該質粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優(you) 化RBD區域，並包含5’和3‘的未翻譯區域（UTR）和一條poly-a尾巴，以未修飾的NTP作為(wei) 原料和T7聚合酶體(ti) 外進行mRNA的合成，使用了牛痘加帽係統（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)進行加帽。

總結：轉錄采用兩(liang) 步法，需要加帽酶的參與(yu) 。

（二）mRNA製備過程原料

mRNA製備過程需要用到的主要原料包括質粒DNA模板、一係列酶（主要為(wei) 7種酶）以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料：質粒

DNA模板生產(chan) ，主要是質粒的生產(chan) 。編碼抗原的DNA模板，通過質粒轉染到大腸杆菌大規模體(ti) 內(nei) 表達，最後提取和純化攜帶目的序列的質粒，即得到DNA模板。目前質粒的生產(chan) 提取和純化工藝很成熟，可以自建生產(chan) 線或者外包出去，例如輝瑞自建質粒生產(chan) 工廠，大部分mRNA企業(ye) 外包，Moderna和國內(nei) 企業(ye) 目前是外包。

製備mRNA質粒的要求：質粒用於(yu) 製備mRNA，這類DNA本身不屬於(yu) API，DNA需要按照GMP規範進行，GMP質粒要求生產(chan) 設備必須是專(zhuan) 用的、符合GMP規範且配備潔淨間。

 2、mRNA體(ti) 外轉錄所需原料：一係列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發與(yu) 生產(chan) 需要一係列酶的參與(yu) ：mRNAT7聚合酶、無機焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基轉移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶。

如下表：

2.1轉錄過程所需要的酶

RNA聚合酶體(ti) 係：RNA聚合酶是體(ti) 外轉錄mRNA的關(guan) 鍵酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分別對T3、T7和SP6噬菌體(ti) 啟動子具有高度的特異性。將目的基因序列克隆到T7和SP6啟動子下遊的多克隆位點中，以克隆的DNA為(wei) 模板體(ti) 外合成相應的RNA。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特異識別T7啟動子序列，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為(wei) 模板，以核甘酸（NTP）為(wei) 底物，合成與(yu) 啟動子下遊的單鏈DNA互補的RNA。

無機焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入無機焦磷酸酶，增加RNA產(chan) 量。無機焦磷酸酶（PPase）可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，可以為(wei) 蛋白、RNA和DNA的生物合成反應提供動力，促進產(chan) 物的生成。在工業(ye) 化生產(chan) mRNA疫苗的時候會(hui) 產(chan) 生大量的無機焦磷酸鹽，為(wei) 了保證mRNA疫苗高效生產(chan) ，可以添加無機焦磷酸酶，可解除生成的無機焦磷酸鹽對反應體(ti) 係的抑製。

RNase抑製劑【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解。少量RNase在RNA製備過程中引入，會(hui) 導致RNA的降解，汙染可能通過實驗過程中使用的槍頭、試管（離心管）和其他試劑引入。通常使用RNase抑製劑作為(wei) 減少和控製此類汙染物的預防措施。

RNase抑製劑能與(yu) RNaseA形成1:1複合體(ti) ，抑製RNase活性，在mRNA疫苗研發和生產(chan) 過程需要保持mRNA的穩定性以保證疫苗高質量的生產(chan) 。

2、轉錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發中常進行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是zui豐(feng) 富的RNA修飾，一般由尿苷的異構化產(chan) 生，mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個(ge) 功能：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。

3、加帽和加尾：共轉錄加帽/模板加尾，轉錄後加帽/加尾

真核生物體(ti) 內(nei) 會(hui) 對轉錄形成的mRNA進行加帽，即在mRNA的5’端添加一個(ge) 甲基化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN結構），從(cong) 而保護mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩定性，並且協助mRNA與(yu) 核糖體(ti) 的結合以促進翻譯起始。生物體(ti) 內(nei) 的帽子結構有cap0，cap1，cap2三種形式，牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基轉移酶處理即可得到cap1帽子。

此外，5'帽子還參加mRNA前體(ti) 的剪接，參與(yu) mRNA3'末端多聚腺苷酸化，保證mRNA在細胞質中的穩定運輸。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的穩定性和啟動mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時之內(nei) 對mRNA進行加帽，效率接近100%。

在mRNA疫苗研發生產(chan) 過程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA穩定表達的效率對疫苗的工業(ye) 化生產(chan) 有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體(ti) 係加帽的mRNA在細胞內(nei) 的表達效率大於(yu) 帽子類似物mRNA的表達效率。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強mRNA的穩定性、提高翻譯起始效率、引導mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基轉移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴，如何替代加帽酶？

一步法合成mRNA疫苗產(chan) 品的加帽可以在mRNA的體(ti) 外轉錄過程中通過摻入“帽子序列"實現，這種加帽技術會(hui) 將加帽序列反向加在mRNA上，在反應體(ti) 係中加入5’帽類似物，可以省一個(ge) 加帽酶，以及減少純化步驟，一定程度上降低成本（尤其是節省了昂貴的加帽酶成本），但相對應地，產(chan) 量較之兩(liang) 步法（加帽酶參與(yu) ）減少，因為(wei) 加帽酶的加帽效率更高。

4、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成後的產(chan) 物可能會(hui) 有DNA殘留，在疫苗開發階段，殘留的去除是關(guan) 鍵的步驟，以減少下遊純化難度並增加產(chan) 品的純度。需要用DNA酶（DNAase將殘留的DNA模板進行消除，在mRNA疫苗生產(chan) 的過程中對DNA的殘留控製非常嚴(yan) 格格。

二、關(guan) 於(yu) 遞送係統（LNP）原料

mRNA分子量大、親(qin) 水性強，但自身的單鏈結構致使其極為(wei) 不穩定，易被降解，自身攜帶負電荷，穿過表麵同為(wei) 負電荷的細胞膜遞送是難題，所以需要特殊的修飾或包裹遞送係統才能實現mRNA的胞內(nei) 表達，遞送技術是mRNA公司的核心專(zhuan) li技術。

脂質納米顆粒（Lipidnanoparticle，LNP）是目前主流的遞送載體(ti) 方式。由於(yu) 其比較容易被抗原呈遞細胞吸收，因此最常被用於(yu) 疫苗，目前三大mRNA疫苗ju頭企業(ye) ，Moderna、CureVac和BioNTech xin冠疫苗均采用了LNP遞送技術。

此外還有陽離子脂質複合物(lipoplex，LPX)、脂質多聚複合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物納米顆粒（Polymernanoparticles，PNP）、無機納米顆粒（Inorganicnanoparticles，INP）陽離子納米乳（Cationicnanoemulsion，CNE)，以及瑞博生物自主研發的GalNacN-乙酰半乳糖胺技術，能夠進行肝髒的定點傳(chuan) 遞。

 （一）LNP為(wei) 主流的遞送載體(ti) 方式

zui廣泛應用的LNP組成成分：聚乙二醇脂質、膽固醇、合成磷脂、可電離陽離子脂質、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5種：

1）mRNA；

2）陽離子脂質，與(yu) 帶負電的mRNA結合，LNP最關(guan) 鍵的成分；

3）膽固醇，介導LNP內(nei) 吞，以及穩定LNP結構（膽固醇有助於(yu) 增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩定性）；

4）磷脂酰膽堿，輔助型脂質，可以在內(nei) 吞時加快mRNA的釋放；

5）聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，提高LNP穩定性。

 1、陽離子脂質體(ti) ：LNP最關(guan) 鍵的成分，是LNP逃離內(nei) 體(ti) 的關(guan) 鍵成分

目前Moderna、輝瑞、BioNTech，Curevac，Acuitas，Genevant等公司都自行篩選或授權從(cong) 其他公司購買(mai) 的陽離子類脂質分子作為(wei) 主要遞送材料，每家公司材料具體(ti) 結構各不相同，但都屬於(yu) 特定條件下戴正電荷的陽離子脂質。

陽離子脂質體(ti) 開發，在遞送效率和細胞毒性之間平衡。可電離陽離子脂質作用是LNP遞送係統的關(guan) 鍵，提高mRNA的體(ti) 內(nei) 穩定性，並幫助mRNA逃避溶酶體(ti) 的降解。

在生產(chan) 原液時，將mRNA和陽離子脂質體(ti) 在特定PH值下混合一起，則陰離子mRNA就會(hui) 和陽離子脂質體(ti) 產(chan) 生靜電吸引融合在一起，一旦LNP被細胞吸收，核內(nei) 體(ti) 的低pH環境將會(hui) 融合LNP，從(cong) 而釋放mRNA進入胞質溶膠。

陽離子脂質作為(wei) 載體(ti) 有著廣闊的應用前景，一些陽離子脂質會(hui) 引起細胞毒性。陽離子脂質的細胞毒性取決(jue) 於(yu) 其親(qin) 水性頭基的結構，含有季銨頭基的兩(liang) 親(qin) 分子比含有叔胺的兩(liang) 親(qin) 分子毒性更大。陽離子有細胞毒性，解決(jue) 對人體(ti) 的副反應是關(guan) 鍵，可電離陽離子脂質是LNP技術的核心，也是專(zhuan) li保護的重點。

2、非陽離子脂質：膽固醇，介導LNP內(nei) 吞，穩定LNP結構

膽固醇有利於(yu) 確保LNP的雙層結構及脂質的流動性。中性脂質（如各種磷脂）也是用於(yu) 構建LNP雙層結構的，因為(wei) 陽離子脂質體(ti) 的雙層結構並不穩定。

3、PEG-lipid：

PEG修飾的脂質體(ti) 形成親(qin) 水保護層，維持LNP空間的穩定性，聚乙二醇在顆粒表麵可屏蔽血漿蛋白等成分結合顆粒，以避免LNP顆粒在體(ti) 內(nei) 被清除。

PEG-脂質結合物也可能引起不期望的毒性，含有PEG的LNP已知脂質結合物與(yu) 免疫細胞相互作用，產(chan) 生針對某些聚乙二醇化脂質的不希望出現的抗體(ti) 。

4、磷脂酰膽堿，輔助型脂質，可以在內(nei) 吞時加快mRNA的釋放。

5、其他賦形劑：有利於(yu) 穩定pH、溫度等。

（二）LNP遞送係統專(zhuan) li壁壘

LNP遞送係統的核心壁壘其實是材料的專(zhuan) li。Arbutus公司在2009年持有的US8058069號專(zhuan) li和2015年在中國申請的CN1021192178專(zhuan) li對於(yu) 核酸和陽離子脂質混合物進行了非常全麵的保護，對於(yu) 幾乎所有陽離子脂質和核酸和混合物，都進行了覆蓋，預計到2029年到期，到期之前專(zhuan) li保護難以撼動。

069核心專(zhuan) li內(nei) 容：

包含一種或多種活性劑或治療劑的新型穩定脂質顆粒、製備脂質顆粒的方法和遞送和/或施用脂質顆粒的方法；更具體(ti) 地，包含核酸(例如一種或多種幹擾RNA)的穩定核酸-脂質顆粒(SNALP)、製備SNALP的方法和遞送和/或施用SNALP的方法；一種核酸-脂質顆粒，包括：

(a)核酸；

(b)占顆粒中總脂質的50mol%至65mol%的陽離子脂質；

(c)包含磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物的非陽離子脂質，其中磷脂占顆粒中存在的總脂質的4mol%至10mol%，膽固醇或其衍生物占顆粒中存在的總脂質的30mol%至40mol%；

(d)抑製顆粒聚集的綴合脂質，其占顆粒中總脂質的0.5mol%至2mol%

（三）脂質包封過程所需原料

1、LNP遞送係統的關(guan) 鍵原料:可離子化脂質、PEG脂質、DSPC脂質、膽固醇。

LNP直徑為(wei) 80-100nm，每個(ge) 脂質納米粒含有約100個(ge) mRNA分子。以ModernamRNA-1273疫苗為(wei) 例：脂質壁由四種不同的化合物組成，

1）SM-102——專(zhuan) 有陽離子脂質，是構成納米顆粒壁的基本結構

2）DSPC——磷脂酰膽堿，助力納米顆粒的壁結構

3）膽固醇——膽固醇存在於(yu) 人體(ti) 所有的細胞膜中，根據溫度的不同，膽固醇有助於(yu) 增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩定性。

4）PEG-2000DMG——一種融於(yu) 聚乙二醇的脂質，能幫助納米顆粒的形成。

專(zhuan) 有陽離子脂質ALC-0315（輝瑞）和SM-102（Moderna）這兩(liang) 種脂質都是叔胺，在低pH值下質子化（因此帶正電），在mRNA傳(chuan) 遞後實現安全清除。PEG脂質都是PEG-2000結合物。

LNP和mRNA的顆粒是通過自組裝形成，通過兩(liang) 種液體(ti) 按照適當的的流速和配比形成。基本原理：T型管一端是RNA的水溶液，一端是脂質的乙醇溶液，通過兩(liang) 相的快速混合，從(cong) 而讓LNP完成自主裝，需要控製水相和乙醇相的流速比，設計管道的形狀。

 脂質體(ti) 的結構在很大程度上取決(jue) 於(yu) 它們(men) 的製備方法。脂質體(ti) 可以是直徑20-100nm的單層（小的單層）囊泡（SUV），直徑為(wei) 100-1000nm的大單層囊泡（LUV）-1000nm或直徑>1000nm的巨大單層囊泡（GUV）或直徑>500nm的多層囊泡（MLV）。藥物輸送係統主要使用SUV和小型MLV，而GUV主要用作細胞模型。粒徑是決(jue) 定脂質體(ti) 藥物包封率和循環半衰期的一個(ge) 關(guan) 鍵參數，較小的脂質體(ti) 更有可能逃脫吞噬細胞的攝取。

脂質納米顆粒生產(chan) 過程：LNP是在低pH（pH4.0）下製備的，此時可電離脂質帶正電荷，因此它很容易與(yu) 每個(ge) 脂質納米粒約100個(ge) mRNA分子形成複合物。微流控裝置用於(yu) 將水中含有mRNA的流與(yu) 乙醇中含有脂質混合物的流混合。當快速混合時，這兩(liang) 種流的成分形成納米粒，將帶負電的mRNA包埋。

如何組裝LNP是mRNA疫苗生產(chan) 最大的Know-how，需要控製LNP的組分、粒度、流量、流體(ti) 形態等參數，來完成結構複雜的納米微粒組裝。目前從(cong) 微流控到T型混合裝置核心技術掌握在極少數企業(ye) 手中。

BioNTech/Pfizer xin冠疫苗的納米脂質體(ti) 顆粒（LNPs）生產(chan) 采用衝(chong) 擊式射流混合法，，采用高壓泵，讓mRNA溶液和脂質體(ti) 溶液形成兩(liang) 股射流，在一個(ge) 腔體(ti) 中進行對衝(chong) ，從(cong) 而產(chan) 生劇烈的湍流。這種湍流能讓LNP各個(ge) 組分充分地混合，從(cong) 而形成包裹mRNA的納米脂質體(ti) 。

采用德國Knauer研發生產(chan) 的IJM（碰撞噴射混合器）。規模化生產(chan) 的衝(chong) 擊式射流混合器結構和參數是根據Moerna、BioNTech等企業(ye) 需求量身定製。