ECL Plus 高敏發光液 說明書

使用方法

1. 執行常規SDS-PAGE、轉膜和Western Blot步驟。注意用HRP標記lgG或用一抗-鏈親(qin) 和素-生物素-HRP夾法。

 注：優(you) 化抗原和抗體(ti) 的濃度。必須使用建議的抗體(ti) 稀釋度，以保證陽性結果。

1) 將一抗濃度稀釋到0.05～1ug/ml

2) 將二抗濃度稀釋到0.005～0.04ug/mL

3) 將兩(liang) 種底物組份按1:1比例混合，製備底物工作液。

注：暴漏於(yu) 日光或任何其他強光可能損害工作液，為(wei) 獲得最佳結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，並避免長期暴漏於(yu) 任何強光。短時間暴漏於(yu) 實驗室常規照明不會(hui) 損害該工作液。

4) 將印跡膜在ECL底物工作液中孵育5分鍾。

5) 吸出多餘(yu) 試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。

6)  使印跡膜在X光膠片上曝光。

2. Western Blot最後一次洗膜的同時新鮮配製發光工作液：分別取等體(ti) 積的溶液A和B，放入幹淨容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數小時後仍可使用但靈敏度略有降低。

3. 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝幹洗液但勿使膜幹燥。將膜浸入發光工作液（0.125mL發光工作液/cm2膜）中，與(yu) 發光工作液充分接觸。室溫孵育3分鍾，準備立即壓片曝光。孵育時間過長不會(hui) 增加靈敏度，有時還會(hui) 導致曝光條帶異常。發光過程的本質是酶促反應，使用過少的發光工作液不利反應進行，也會(hui) 導致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為(wei) 達節約目的可將膜剪小但勿降低發光液用量。

4. 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝幹發光工作液。但勿洗去發光液。

5. 打開X光膠片暗盒，在暗盒內(nei) 表麵鋪一張麵積大於(yu) 膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多餘(yu) 的保鮮膜。用濾紙吸去多餘(yu) 的發光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nei) ，蛋白帶麵向上。

6. 暗房內(nei) 壓X光膠片，分別曝光不同的時間如數秒到數分鍾。顯影衝(chong) 洗。      

注意事項

（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發光液曝露於(yu) 強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

（2）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景並使條帶強弱變化失去線性關(guan) 係。曝光不足則條帶模糊。

（3）發光工作液孵育約3分鍾後膜上的條帶發光。強條帶發光在暗房中肉眼可見，低豐(feng) 度蛋白條帶發光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續數小時並使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光後條帶不佳，可用洗膜緩衝(chong) 液洗膜，重新孵育二抗，然後重新用ECL發光和曝光。

（4）由於(yu) 超敏發光液極其靈敏，強烈推薦大多數進口抗體(ti) 起始濃度為(wei) 一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗體(ti) 濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。

（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會(hui) 淬滅熒光，應選擇高質量保鮮膜。

（6）使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

（7）NaN3能抑製HRP活性，回收第二抗體(ti) 應避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。 

（8） 為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

（9） 本產(chan) 品主要用於(yu) 科研領域，不宜用於(yu) 臨(lin) 床診斷或其他用途。