Femto ECL 特超敏發光液說明書

Femto ECL 是一款具有特超高靈敏度的增強型化學發光(ECL)底物，也是我們(men) ECL發光液中的靈敏度非常好的化學發光底物，由於(yu) 采用了核心技術基於(yu) “熒光震蕩"機理設計的發光底物係統。可通HRP實現實現低飛克級(以HRP濃度為(wei) 準)的免疫印跡檢測，其靈敏度，發光時間和背景均明顯優(you) 秀。

其他所需材料

• 已完成轉印的印跡膜：用合適的電泳法分離蛋白質，並將這些蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。

• 稀釋緩衝(chong) 液：使用Tris或磷酸鹽緩衝(chong) 液。

• 洗滌緩衝(chong) 液：將5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀釋緩衝(chong) 液（Tween-20的終濃度將0.05%）。

• 封閉試劑：將0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封閉緩衝(chong) 液，選擇一種與(yu) 稀釋緩衝(chong) 液具有相同基本組分的封閉緩衝(chong) 液。

• 一抗： 選擇一種目標蛋白質特異性抗體(ti) 。使用稀釋緩衝(chong) 液製備該抗體(ti) 的儲(chu) 存液。使用封閉試劑將抗體(ti) 從(cong) 儲(chu) 備液稀釋成抗體(ti) 工作液。最佳稀釋度取決(jue) 於(yu) 一抗和膜上的抗原量。

• HRP標記的二抗：選擇一種與(yu) 二抗特異性結合的HRP標記二抗，使用稀釋緩衝(chong) 液製備該抗體(ti) 的儲(chu) 存液。使用封閉試劑將抗體(ti) 從(cong) 儲(chu) 備液稀釋成抗體(ti) 工作液。稀釋度介於(yu) 1:100000和1:500000之間或抗體(ti) 工作液濃度為(wei) 2～10ng/ml。該濃度範圍在使用鏈親(qin) 和素-HRP時也適用。二抗的最佳稀釋度取決(jue) 於(yu) HRP標記二抗和膜上的抗原量。

• 用於(yu) 處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

• 用於(yu) 孵育的旋轉搖床。

蛋白印跡法詳細操作步驟

1) 將印記膜從(cong) 蛋白轉印設備中取出，加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鍾，同時振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結合位點。請注意：使用在前文建議的抗體(ti) 稀釋度是非常重要的。

2) 將膜從(cong) 封閉液中取出，與(yu) 一抗工作液在溫室孵育1小時，同時振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩衝(chong) 液加至膜上，保證緩衝(chong) 液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5分鍾，更換洗滌緩衝(chong) 液並重複該步驟4-6次。增加洗滌緩衝(chong) 液體(ti) 積，洗滌次數和洗滌時間有助於(yu) 降低背景信號。

注：孵育前，膜在洗滌緩衝(chong) 液中的短暫淋洗會(hui) 提高洗滌效率。

請注意：使用在前文建議的HRP標記二抗稀釋度是非常重要的。

4) 將HRP標記的二抗工作液與(yu) 膜在溫室孵育1小時，同時振蕩。

5) 重複步驟3，以除去未結合的HRP標記二抗。注：膜與(yu) HRP標記二抗孵育後必須進行徹di洗滌。

6) 將A溶液與(yu) B液等比例混合，製備成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液。工作液可以在溫室下穩定8小時。注：暴漏雨日光或任何其他強光下可能損害工作液，為(wei) 獲得最佳結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，並避免長期暴漏雨任何強光。實驗室的常見照明不會(hui) 損害工作液。

7) 將印記膜在工作液中孵育5分鍾。

8) 從(cong) 工作液中取出印記膜，並置於(yu) 一個(ge) 塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多餘(yu) 的液體(ti) ，並從(cong) 印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

9) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置於(yu) 膠片暗盒中，蛋白質麵朝上，除適用於(yu) 膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關(guan) 閉所有的燈。

注;膠片必須在曝光期間保持幹燥，為(wei) 獲得最佳效果，采取以下措施：

*   確保將多餘(yu) 的底物從(cong) 膜和塑料紙上wan全去除。

*   在整個(ge) 膠片處理期間，使用手套。

*   切莫將印記膜置於(yu) 已顯影的膠片上，因為(wei) 膠片上的化學物質會(hui) 減弱信號。

10) 將X光膠片置於(yu) 膜的上麵。建議第一次曝光60秒。之後可調整曝光時間以達到最佳結果。化學發光反應在底物孵育後的前5-30分鍾期間是zui強烈的。這一反應可以持續幾個(ge) 小時，但強度會(hui) 隨時間下降，如有底物孵育後較長時間後曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲(chu) 成像設備（如Bio-Rad的分子成像儀(yi) 係統）或CCD照相機可能需要較長的曝光時間。

   警告：膠片與(yu) 膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為(wei) 的非特異信號。

11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強，則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離並降低抗體(ti) 濃度重新檢測。