POLYPEI轉染試劑說明書

產(chan) 品描述

細胞轉染是指將外源分子導入真核細胞內(nei) 以改變其基因型或表型的一種技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為(wei) 研究和控製基因功能的常規手段，廣泛應用於(yu) 基因功能研究、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產(chan) 等領域。轉染大致可分為(wei) 物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。其中化學介導方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(you) 點，應用廣泛。化學介導方法包括經典的磷酸鈣共沉澱法、脂質體(ti) 轉染方法以及多種陽離子物質介導的轉染方法。

理想的細胞轉染方法應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(you) 點。已有眾(zhong) 多文獻報道，脂質體(ti) 本身會(hui) 參與(yu) 細胞生理活動，影響基因表達，對研究數據產(chan) 生一定程度的幹擾。同時，脂質體(ti) 會(hui) 對目的細胞造成細胞毒性，這種毒性是由其脂質特性決(jue) 定的。市麵上多種商業(ye) 化的脂質體(ti) 轉染試劑要求細胞鋪板密度較高，以90%-95%為(wei) 佳，這有助於(yu) 減少陽離子脂質體(ti) 細胞毒性造成的影響。但是，如果研究的基因要求比較長的表達時間，例如細胞周期相關(guan) 基因，或者細胞表麵蛋白，又或者轉染後續需要進行繼續培養(yang) 和功能研究，則不適合用脂質體(ti) 核酸轉染試劑。目前眾(zhong) 多的研究者和生物公司將新一代轉染試劑的開發聚焦在非脂質體(ti) 的聚合物上，以尋找更高效低毒，同時對研究影響較小的轉染試劑。

PolyShooter^TM Transfection Reagent是一種基於(yu) 陽離子高分子聚合物的新型轉染試劑，適用於(yu) DNA、RNA的轉染。其原理為(wei) 帶正電的高分子聚合物與(yu) 核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的複合物後，與(yu) 細胞表麵帶負電的蛋白多糖相互作用，並通過內(nei) 吞作用進入細胞，隨後在胞質中釋放，實現外源核酸的細胞轉染。

PolyShooter^TM Transfection Reagent對多種常見細胞具有高水平轉染效率，具有高效低毒、操作簡單、重複性好等優(you) 點。其du特的配方使其可直接加入培養(yang) 基中，血清的存在不會(hui) 影響轉染效率，這樣可以減少去除血清對細胞的損傷(shang) 。同時，轉染後不需要除去PolyShooter^TM Transfection Reagent-核酸複合物或更換新鮮培養(yang) 基，也可根據具體(ti) 情況優(you) 化轉染體(ti) 係。

產(chan) 品特點

²  zhuo越的轉染效率——針對廣泛類型的細胞，均表現出zhuo越的轉染效率和高重組蛋白表達水平

²  細胞毒性低——作用溫和，能較好地實現高轉染效率與(yu) 低細胞毒性之間的平衡

²  操作簡單——在血清存在時亦具有可靠的轉染效率，轉染後無需去除複合物或更換新鮮培養(yang) 基

²  高性價(jia) 比——經濟的價(jia) 格，同時實現高效的轉染效果

PolyShooter^TM Transfection Reagent采用陽離子高分子聚合物為(wei) 主要成分，適用於(yu) DNA、RNA的轉染。

使用方法使用方法

（以24孔板為(wei) 例，其他培養(yang) 板加樣體(ti) 積參考表一：轉染量度標準）

1: 準備待轉染細胞

貼壁細胞：轉染前一天，將胰酶消化後的細胞按照每孔0.5-1.5x10⁵個(ge) 細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為(wei) 50%左右。

懸浮細胞：轉染當天，配製轉染試劑-核酸複合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500 µL生長培養(yang) 基中加入1-3x10⁵個(ge) 細胞。

Ø  細胞狀態會(hui) 極大影響轉染效率，待轉染細胞應處於(yu) 良好生長狀態，建議使用生長處於(yu) 指數期、存活率大於(yu) 90% 的細胞進行轉染。

2: 準備PolyShooter^TM轉染試劑-核酸複合物

（1）取1 μg質粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL* PolyShooter^TM 轉染試劑與(yu) 質粒混合，室溫孵育3分鍾。

Ø   * 轉染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和 PolyShooter^TM轉染試劑（μL）的用量比例為(wei) 1：2.5。建議初次使用時，可在1：2-1：5的範圍內(nei) 調整以優(you) 化轉染效果。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎培養(yang) 基（與(yu) 培養(yang) 體(ti) 係一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鍾，形成PolyShooter^TM轉染試劑-核酸複合物。

Ø  PolyShooter^TM轉染試劑-核酸複合物在室溫下4個(ge) 小時內(nei) 保持穩定。

3: 細胞轉染

給細胞更換新鮮的預熱的wan全培養(yang) 基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter^TM 轉染試劑-核酸複合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yang) 板混勻。

Ø  對於(yu) 懸浮細胞係：轉染5小時後，可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動子的活性並促進基因表達。對於(yu) Jurkat細胞，PHA和PMA的終濃度分別為(wei) 1 µg/mL和50 ng/mL，可以提高CMV啟動子活性和基因表達。對於(yu) K562細胞，隻加入PMA足以提高啟動子活性。

4. 分析轉染細胞

轉染細胞培養(yang) 24-48小時後，可根據實際情況用熒光檢測法、Western Blot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術、報告基因等檢測轉染效果，或加入篩選藥物進行穩定細胞株的篩選。

表一：轉染量度標準

實驗案例分析

09/實驗案例分析

1: 轉染前一天，將圖2所示9種狀態良好的細胞接種於(yu) 24孔板，使其在轉染時密度約為(wei) 50%。

2: 按照每孔計量，取1μg GFP質粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL PolyShooter^TM Transfection Reagent與(yu) 質粒混合，室溫孵育3 min後，往混合物

加入100 μL無血清基礎DMEM培養(yang) 基，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成PolyShooter^TM轉染試劑-核酸複合物。

3: 給細胞更換新鮮的預熱的wan全培養(yang) 基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter^TM 轉染試劑-核酸複合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yang) 板混勻。

4：轉染細胞培養(yang) 48小時後，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，並拍照記錄，實驗結果如圖2所示。

圖2: 轉染細胞培養(yang) 48小時後，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

注意事項

1. 核酸質量：想要獲得最高的轉染效率和最di的細胞毒性，應選用高純度、無菌、無汙染、無內(nei) 毒素的優(you) 質核酸。質粒中的內(nei) 毒素是轉染的大敵，內(nei) 毒素會(hui) 導致轉染效率顯著下降，特別是對內(nei) 毒素敏感的細胞，例如原代細胞、懸浮細胞、造血細胞等。推薦使用無內(nei) 毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取，保證質粒A₂₆₀/A₂₈₀比值為(wei) 1.8-2.0。同時，需合理計算質粒用量，轉染過量的質粒可能會(hui) 導致細胞毒性甚至死亡；

2. 細胞質量：細胞狀態會(hui) 極大影響轉染效率，建議使用生長處於(yu) 指數期、存活率大於(yu) 90%的細胞進行轉染；

3. 細胞密度：建議細胞傳(chuan) 代後12-24 h內(nei) 、細胞密度約為(wei) 50%時進行轉染。不同的細胞轉染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞係的轉染時，需要根據說明書(shu) 再次優(you) 化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數據的可重複性；

4. 質粒與(yu) 轉染試劑使用比例：對於(yu) 大多數細胞係，轉染複合物中DNA (μg)與(yu) PolyShooter^TM Transfection Reagent (μL) 的比例在1：2至1：5之間，推薦比例為(wei) 1:2.5。想要獲得好的轉染結果，需要對這一比例進行優(you) 化，根據所轉染細胞及質粒選擇適合的轉染比例；

5. PolyShooter^TM Transfection Reagent可用於(yu) 有血清培養(yang) 基的轉染，並且轉染前後不需要換培養(yang) 基。但是，製備轉染複合物時要求用無血清基礎培養(yang) 基稀釋DNA和轉染試劑，因為(wei) 血清會(hui) 影響複合物的形成；

6. 由於(yu) 一些特殊培養(yang) 基中的某些成分可能會(hui) 抑製陽離子聚合物介導的轉染，因此有必要檢測特殊培養(yang) 基與(yu) PolyShooter^TM Transfection Reagent的相容性；

7. 為(wei) 了您的健康安全，請規範操作，穿戴實驗服與(yu) 手套開展實驗；

8. 本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及治療。

運輸及保存方法

冰袋（wet ice）運輸。4℃保存，有效期6個(ge) 月。-30℃至-10℃保存，有效期12個(ge) 月，避免反複凍融。