PH值檢測通過中國藥典 2020 版第四部 pH 值測定法(通則 0631)
檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
檢測遵循USP Chapter<1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用於(yu) 細胞治療，基因治療和組織工程產(chan) 品中的輔料。
細菌內(nei) 毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則（1143）方法2光度測試法（動態濁度法）
重金屬殘留檢測符合國藥典 2020 版第四部重金屬檢查法(通則 0821)
支原體(ti) 檢測 使用支原體(ti) 檢測試劑盒
質量信息表
產品特點
BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數表達係統中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩定的高表 達（96 孔板至 100L 生物反應器）。現在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進行細胞轉染.。
GMP級別定製監管，支持並滿足合規要求。
不含動物源性成分。
嚴(yan) 格遵循以下規範生產(chan) 1. ISO 9001:2015, certified facility。
嚴(yan) 格按照《GMP 附錄-細胞治療產(chan) 品》國家藥品監督管理局。
從(cong) 工藝開發到臨(lin) 床試驗和商業(ye) 化的無縫過渡生產(chan) 細胞係（HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chan) 量。
操作方法參考
一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為例：
（一）轉染前準備
1) 轉染前一天：用膠原酶 I型（78CL10002)消化細胞並計數（不建議用胰酶）。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養基和 1ml 的細胞懸液)置於 37°C,5%CO2培養 箱培養 24h。
2) 24h 後,移除之前培養基，每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意：確保 293T 細胞生長狀態良好傳代 不超過 15 代。
（二）轉染過程
3) 第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度， 當細胞達到 70%到 80%的匯合度時，開始準備轉染。
4) 對於每孔細胞，用 100µl 無血清培養基（如 OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml（DNA/總培養體積）。
5) 對於每孔細胞，用 100μL 無血清培養基（如 OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP 的比例要依據自己實驗摸索最適比例。
6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中（總體積 200µL）輕輕混勻， 室溫孵育 30 分鍾。
7) 小心地將 BIOHUB-PRO GMP複合物滴加到細胞培養板每個孔中，輕輕搖動培養板混勻。注 意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
8) 將培養板放入 37°C，5%CO2培養箱培養中培養 24h。
（三）觀察轉染結果 9) 第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過 80%的 293T 細胞在轉染後的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進行不同基因轉染時應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進行優化，以達到最適比例， 通常篩選範圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過進口品牌的 PEI，用BIOHUB-PRO GMP時應適當 降低使用濃度。
通常情況下，分別準備BIOHUB-PRO GMP GMP和 DNA 轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培 養液體積總量的 1/10-1/20，如細胞培養液體積為 3ml，則稀釋BIOHUB-PRO GMPI及 DNA 的體積為150ul。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質量/細胞培養總體積）[1][4]。 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率，如較大片段插入質粒可能轉染效率低，可根據 實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。 HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反複吹打，但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞，如果表達的是膜蛋白，胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達， 建議用膠原酶消化細胞，我們推薦用(78CL10002)的膠原酶。 對於貼壁性低的細胞係，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與培養皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類型、培養基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例，就可以在轉染後 24 至 96 小時內多次觀察轉染效率，以優化最大表達量時間點。
二、懸浮細胞轉染 離心對數期生長的細胞用新鮮的培養基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規模轉 染時，如需大規模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 細胞 於 100mL 培養瓶（溶液體積占瓶體積的 1/5）操作體係舉例如下：
（一）轉染前準備
1) HEK293F 細胞傳代接種於 20mL 懸浮細胞生長培養基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的條 件下培養。當細胞密度到 1X10 6cells/mL，然後旋緊瓶口放入搖床繼續培養，2~4 小時 後可以進行轉染。
（二）轉染過程
2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無血清培養基)稀釋適量的 DNA，使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總 培養體積）。混勻並靜置 5min。
3) 用1mlOptiPRO™SFM(無血清培養基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻並靜置 10min。
（78BioPEI：DNA 參考比例範圍，可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO GMP和 DNA 優化方案優化）。
4) 將BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中輕輕混勻，室溫孵育 30 分鍾。
5) 將BIOHUB-PRO GMP轉染複合物逐滴加入到細胞培養液中，搖勻後旋緊瓶口放回搖床 （36.5℃，5%CO2，120rpm）。
6) 基因表達可在 24-72 小時後檢測，具體時間取決於細胞係和轉基因.
小貼士:在懸浮培養中，單個細胞的轉染效率要高於聚集在一起的細胞，需要優化適合單細胞的 生長條件。 方形瓶應經過兩個連續的幹燥循環高壓滅菌（每個 45 分鍾，幹燥 15 分鍾） 蓋子應盡可能鬆，不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前，將其wan全放入層流罩中。如 果瓶子向內塌陷，細胞將無法正常生長。 如果要獲得更多的蛋白產量，有參考文獻表明轉染後 24 小時，可以適當稀釋細胞，稀 釋比例參考範圍（1:2—1:5）之間，可以增加蛋白產量，稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據經驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進行轉染，但必須經過上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優化。
注意事項
不同質粒種類以及大小會(hui) 影響轉染效率，可如較大片段插入質粒可能轉染效率低，可根據實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。
細胞狀態及代數會(hui) 較大程度影響轉染。剛複蘇細胞需傳(chuan) 代2-3次以上，待細胞生長穩定後做轉染實驗。為(wei) 保證實驗穩定性，轉染細胞盡量選擇20代以內(nei) 進行實驗。
對於(yu) 貼壁性低的細胞係，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與(yu) 培養(yang) 皿之間的粘附性。
初次使用應優(you) 化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉染效率。 DNA 和轉染試劑的比例， 通常推薦是1:2-1:3，通過調整DNA/BIOHUB-PRO GMP轉染試劑比例優(you) 化轉染效率，調整範圍DNA（μg）:BIOHUB-PRO GMP（μL） 比值在1：0.5-1：5。
為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
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